機器視覺增強的Argonaute熒光傳感器：一種簡化的食品中活沙門氏菌檢測方法
發(fā)布時間：2025-04-07 瀏覽次數(shù)：111
1. 引言
多菌靈（CBZ）是一種有效的農(nóng)業(yè)殺菌劑，但其過度使用導致農(nóng)藥殘留在環(huán)境和食品中積累，從而對人類健康構(gòu)成威脅。因此，開發(fā)簡單、快速和靈敏的檢測方法顯得尤為重要。電化學傳感技術(shù)因其快速、簡便和高靈敏度而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測。電化學傳感器的靈敏度主要依賴于電極材料的催化性能。近年來，金屬有機框架（MOF）衍生的多孔碳材料因其良好的導電性和高比表面積而受到關(guān)注。然而，這些材料的微孔結(jié)構(gòu)限制了金屬催化位點的利用率，提高活性位點的暴露率是提升催化活性的關(guān)鍵。
本研究報道了一種通過一步熱解策略合成具有大孔壁、集成CoS和CoFe多摻雜納米顆粒的中空泡沫碳（CoS-FeCo-HSNC）。該方法使用ZnCo-MOF作為犧牲模板，CdS納米顆粒作為介孔引發(fā)劑，鐵離子作為開壁大孔引發(fā)劑。熱解過程中，Zn和Cd揮發(fā)形成中空介孔結(jié)構(gòu)，而殘余硫促進了CoS的形成。鐵離子融合到碳骨架中，將封閉壁轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放大孔，形成Fe-N活性位點。這種開放壁結(jié)構(gòu)的分層多孔泡沫碳集成了多種活性成分，提供了高效的電子傳遞途徑和活性位點的局部可達性。最終，將制備的層次化多孔CoS-FeCo-HSNC作為檢測蔬菜和水果中CBZ的電化學傳感平臺。
方案1. 用于檢測活鼠傷寒沙門氏菌的AFPAM生物傳感器示意圖，無需復雜的DNA提取和擴增程序。(A)用于鼠傷寒沙門氏菌檢測的AFPAM生物傳感器示意圖。(B)機器視覺和機器學習介導的圖像處理和數(shù)據(jù)分析?？潭葹?.2 mm。
2. 結(jié)果與討論
AFPAM生物傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌檢測的主要證明及表征
本研究開發(fā)了一種機器視覺和學習輔助的噬菌體與CbAgo介導的熒光生物傳感器，用于檢測活的鼠傷寒沙門氏菌。該方法利用羧酸磁性納米顆粒（MNPs）與噬菌體形成的偶聯(lián)物，從食物中快速分離活菌。然后使用RIPA裂解緩沖液釋放DNA，并通過CbAgo與特定gDNA結(jié)合，靶向切割熒光探針，產(chǎn)生熒光信號。熒光探針被富集在鏈霉親和素修飾的PS微球上，通過機器視覺算法識別熒光強度，實現(xiàn)檢測。這種方法無需復雜的DNA提取和擴增程序，具有高靈敏度和特異性。
熒光信號集成在單個毫米微球的表面，利用鏈霉親和素修飾的聚苯乙烯（PS）微球作為熒光信號富集載體。通過將鏈霉親和素偶聯(lián)于羧基PS微球表面，制備了PS0.5 mm-SA和PS1 mm-SA微球。在相同熒光探針濃度下，PS0.5 mm-SA的熒光更強、更集中，因此被選用進行后續(xù)實驗。PS0.5 mm-SA與生物素化探針結(jié)合，形成復合物，在激發(fā)光下發(fā)出熒光信號。這些信號通過倒置熒光顯微鏡捕捉，并使用機器視覺算法識別熒光強度，獲得相應(yīng)的信號特征值。
圖1. AFPAM生物傳感器中CbAgo靶向切割特性驗證圖及納米顆粒表征。
基于機器視覺和學習的PS微球信號讀出系統(tǒng)原理
本研究的機器視覺和學習算法處理圖像的工作流程主要包括兩部分：基于機器視覺的熒光信號采集和轉(zhuǎn)換，以及基于機器學習的彈性網(wǎng)絡(luò)回歸模型。通過將熒光信號整合到毫米微球上，消除了傳統(tǒng)顯微成像的視野損失，提高了檢測靈敏度。采用雙邊濾波和自適應(yīng)閾值分割算法處理熒光圖像，計算平均熒光強度以減少局部異常光點的影響。彈性網(wǎng)絡(luò)回歸模型建立了微球平均熒光強度與鼠傷寒沙門氏菌濃度之間的線性關(guān)系，表現(xiàn)出更高的準確性和魯棒性。這種方法在食品樣品中檢測鼠傷寒沙門氏菌時不需要復雜的DNA提取和擴增程序。
圖2. 基于機器視覺的AFPAM生物傳感器PS微球信號讀出系統(tǒng)。
AFPAM生物傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌的靈敏度研究
AFPAM生物傳感器在優(yōu)化條件下檢測不同鼠傷寒沙門氏菌濃度的靈敏度進行了評估。熒光信號通過生物素-親和素相互作用在單個PS0.5 mm-SA微球上富集，隨著鼠傷寒沙門氏菌濃度增加，熒光強度呈線性增加（R2 = 0.99）。檢測限（LOD）為40.5 CFU/mL，與傳統(tǒng)方法相比，AFPAM生物傳感器無需DNA擴增，靈敏度提高約15倍。與qPCR方法相比，AFPAM傳感器能夠區(qū)分活菌和非活菌，避免假陽性結(jié)果。該方法簡化了DNA提取過程，提高了檢測效率。
圖3. AFPAM生物傳感器分析性能圖。
AFPAM生物傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌的特異性研究
AFPAM生物傳感器的高特異性是其有效性的關(guān)鍵組成部分。該傳感器利用噬菌體LPST10特異性識別活的鼠傷寒沙門氏菌，并通過特定引物與CbAgo蛋白的結(jié)合，實現(xiàn)靶向切割熒光探針。實驗結(jié)果表明，僅鼠傷寒沙門氏菌DNA與引物匹配時才會產(chǎn)生明顯的熒光信號，其他致病菌的DNA產(chǎn)生的信號與空白對照幾乎一致。這證明了AFPAM傳感器的高選擇性。
在實際樣品檢測中，AFPAM傳感器能夠準確地檢測食品樣品中的鼠傷寒沙門氏菌，平均回收率在93.22% ~ 106.02%之間。與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法和qPCR法相比，AFPAM傳感器的檢測結(jié)果具有更好的一致性（R2 = 0.96和0.97）。這種方法無需復雜的DNA提取和擴增步驟，僅需3小時即可完成定量檢測，靈敏度高于qPCR。然而，AFPAM傳感器目前不適合高通量檢測，需要進一步改進以適應(yīng)大規(guī)模應(yīng)用。
圖4. 利用AFPAM生物傳感器、平板計數(shù)法和標準qPCR法對鼠傷寒沙門氏菌的特異性和真實樣品進行分析。
3. 總結(jié)
本研究設(shè)計了一種創(chuàng)新的機器視覺和學習介導的噬菌體與基于CbAgo的AFPAM生物傳感器，用于快速、簡單和高靈敏度地檢測鼠傷寒沙門氏菌。這種方法無需復雜的DNA提取和擴增程序，利用噬菌體特異性鑒定活鼠傷寒沙門氏菌，并通過RIPA裂解緩沖液釋放其DNA。CbAgo的獨特裂解活性使其能夠在gDNA的引導下對雙鏈和單鏈DNA進行靶向裂解，在室溫下具有較高的裂解活性。AFPAM生物傳感器采用鏈霉親和素修飾的單個聚苯乙烯（PS）微球作為最終測定單元，可以特異性富集生物素化熒光信號探針，從而顯著提高靈敏度。這種方法避免了傳統(tǒng)PCR方法中的DNA擴增步驟，使其相對于大多數(shù)現(xiàn)有熒光傳感器具有優(yōu)勢。同時，該方法采用機器視覺算法進行信號處理，將熒光微球的信號值轉(zhuǎn)換為平均熒光強度，消除微球表面異常亮斑的影響。所提出的AFPAM生物傳感器成功地提供了準確和高靈敏度的定量食品和環(huán)境樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.133648
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~占英。
