1. 引言

快速準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)至關(guān)重要，但傳統(tǒng)方法存在局限性。表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)具有靈敏、快速、無(wú)損等優(yōu)勢(shì)，尤其無(wú)標(biāo)記SERS無(wú)需復(fù)雜標(biāo)記，可直接檢測(cè)細(xì)菌的固有振動(dòng)指紋。然而，SERS分析面臨信號(hào)峰重疊和咖啡環(huán)效應(yīng)導(dǎo)致信號(hào)不均勻等挑戰(zhàn)。為解決這些問(wèn)題，機(jī)器學(xué)習(xí)（ML）與數(shù)據(jù)預(yù)處理技術(shù)結(jié)合，可有效去除噪聲和背景干擾，提高SERS數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，為病原菌的快速鑒定提供了新的途徑。

本研究報(bào)道了一種結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)和數(shù)據(jù)預(yù)處理的無(wú)標(biāo)記疏水SERS平臺(tái)，用于病原菌的快速高通量檢測(cè)。首先優(yōu)化了SERS信號(hào)，并比較了咖啡環(huán)效應(yīng)和疏水富集效應(yīng)下的SERS性能。然后，針對(duì)SERS數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)并評(píng)估了四種機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型：k-NN、SVM-poly、SVM-rbf和1D-CNN。其中，SVM模型被廣泛應(yīng)用于數(shù)據(jù)分類任務(wù)，而CNN模型則擅長(zhǎng)學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)的空間結(jié)構(gòu)和模式。此外，k-NN模型作為一種簡(jiǎn)單的無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)算法也被應(yīng)用于此研究。

2. 結(jié)果與討論

使用疏水SERS平臺(tái)進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)的無(wú)標(biāo)簽SERS分析

本研究利用疏水SERS平臺(tái)進(jìn)行病原菌的無(wú)標(biāo)記快速檢測(cè)。疏水硅片通過(guò)限制液滴擴(kuò)散，使細(xì)菌和納米顆粒集中，產(chǎn)生“局部濃度效應(yīng)”，相比于普通硅片上的“咖啡環(huán)效應(yīng)”，更有利于SERS檢測(cè)。研究人員用該平臺(tái)對(duì)大腸桿菌、單核增生乳桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌四種食源性致病菌進(jìn)行了檢測(cè)，并構(gòu)建了包含800個(gè)光譜的數(shù)據(jù)集。通過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理技術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這四種細(xì)菌的準(zhǔn)確分類。

圖1. 使用疏水SERS平臺(tái)進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)的無(wú)標(biāo)簽SERS分析

細(xì)菌和等離子體粒子混合物在正常和疏水硅襯底上的分布及PNs的表征

利用金核銀殼納米粒子(Au@AgNPs)增強(qiáng)SERS信號(hào)，并比較了普通硅片和疏水硅片作為基底的效果。Au@AgNPs結(jié)構(gòu)均勻，在普通硅片上，由于咖啡環(huán)效應(yīng)，Au@AgNPs和細(xì)菌集中在液滴邊緣；而在疏水硅片上，則集中在中心區(qū)域，形成“局部濃度效應(yīng)”，顯著提高了細(xì)菌和Au@AgNPs的濃度。疏水處理后的硅片接觸角明顯增大，證實(shí)了其良好的疏水性。結(jié)果表明，疏水基底更有利于SERS檢測(cè)，因?yàn)樗茉黾訜狳c(diǎn)成分并使細(xì)菌充分暴露于熱點(diǎn)中。

圖2. 細(xì)菌和等離子體粒子混合物在正常和疏水硅襯底上的分布及PNs的表征

咖啡環(huán)效應(yīng)和局部濃度效應(yīng)下不同PNs配比的SERS活性優(yōu)化

比較了咖啡環(huán)效應(yīng)和局部濃度效應(yīng)下Au@AgNPs對(duì)大腸桿菌的SERS檢測(cè)效果。結(jié)果表明，疏水硅片上的局部濃度效應(yīng)比普通硅片上的咖啡環(huán)效應(yīng)具有更高的靈敏度。在734 cm?1處，局部濃度效應(yīng)的最佳Au@AgNPs濃度為2.6 μg/mL，而咖啡環(huán)效應(yīng)則為21 μg/mL。此外，局部濃度效應(yīng)下的SERS強(qiáng)度比咖啡環(huán)效應(yīng)高33倍，且檢測(cè)限更低。這表明疏水硅片更有利于提高SERS性能，因?yàn)樗苡行岣呒?xì)菌和Au@AgNPs的局部濃度。

圖3. 咖啡環(huán)效應(yīng)和局部濃度效應(yīng)下不同PNs配比的SERS活性優(yōu)化

數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)集準(zhǔn)備

利用機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)四種細(xì)菌的SERS數(shù)據(jù)進(jìn)行分類。由于原始SERS數(shù)據(jù)存在噪聲干擾，研究人員采用了基線校正、平滑和歸一化等預(yù)處理步驟，增強(qiáng)了特征峰譜的清晰度。通過(guò)比較k-NN、SVM-poly、SVM-rbf和1D-CNN四種ML模型的分類性能，研究探索了不同細(xì)菌拉曼光譜的內(nèi)在差異。此外，通過(guò)分析預(yù)處理后鳥(niǎo)嘌呤峰和腺嘌呤峰的相對(duì)強(qiáng)度，驗(yàn)證了在不使用ML模型的情況下，利用SERS光譜區(qū)分細(xì)菌的可行性。

圖4. 數(shù)據(jù)預(yù)處理流程圖，數(shù)據(jù)集準(zhǔn)備，機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型。

圖5. 數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)集準(zhǔn)備

研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)菌的鳥(niǎo)嘌呤/腺嘌呤峰值比存在差異，可用于區(qū)分部分細(xì)菌，但同種細(xì)菌的不同菌株之間也存在信號(hào)差異，例如金黃色葡萄球菌菌株間差異較大，難以區(qū)分。為評(píng)估疏水SERS平臺(tái)的再現(xiàn)性，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了40次重復(fù)測(cè)量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.45%。此外，不同培養(yǎng)溫度(25-42℃)下，疏水基底均能產(chǎn)生均勻的拉曼光譜，但42℃時(shí)腺嘌呤峰信號(hào)減弱，可能與細(xì)菌成分或代謝物變化有關(guān)。結(jié)果表明，疏水基底的局部濃度效應(yīng)保證了SERS信號(hào)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

圖6. (A)種和(B)菌株水平上的鳥(niǎo)嘌呤相對(duì)強(qiáng)度峰比（654 ~ 661 cm^?1）和腺嘌呤相對(duì)強(qiáng)度峰比（734 ~ 737 cm^?1）。數(shù)據(jù)為20個(gè)拉曼光譜的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

使用ML模型的細(xì)菌分類結(jié)果

本研究使用k-NN、SVM-poly、SVM-rbf和1D-CNN四種機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)預(yù)處理后的SERS數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)菌分類。結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)預(yù)處理，尤其是基線校正、平滑和歸一化，顯著提高了模型分類準(zhǔn)確率。未經(jīng)預(yù)處理的原始數(shù)據(jù)中，除k-NN外，其他模型均出現(xiàn)錯(cuò)誤分類。ROC曲線分析也表明，預(yù)處理后模型的AUC值顯著增加。即使在咖啡環(huán)效應(yīng)下，預(yù)處理后的SERS光譜準(zhǔn)確率也能達(dá)到95%以上。研究證實(shí)，數(shù)據(jù)預(yù)處理對(duì)于基于SERS數(shù)據(jù)和機(jī)器學(xué)習(xí)的細(xì)菌分類至關(guān)重要。

圖7. (A)原始數(shù)據(jù)和(B)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)得到k-NN、SVM-poly、SVM-rbf和1D-CNN四種分類模型的混淆矩陣。E.， L.， S., St.：大腸桿菌，單核細(xì)胞增生乳桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌。（C和D）四種分類模型的ROC曲線。

3. 總結(jié)

本研究提出了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高靈敏度的無(wú)標(biāo)記SERS分析方法，用于快速分類和預(yù)測(cè)食源性致病菌。該方法基于疏水SERS底物、數(shù)據(jù)預(yù)處理技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法。研究人員通過(guò)優(yōu)化Au@AgNPs濃度和增強(qiáng)底物疏水性來(lái)誘導(dǎo)局部濃度效應(yīng)，從而提升SERS性能。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的SERS底物強(qiáng)度比利用咖啡環(huán)效應(yīng)的底物高33倍。為了提高SERS光譜的清晰度，研究人員采用了基線校正、平滑和歸一化三個(gè)預(yù)處理步驟，并結(jié)合k-NN、SVM-poly、SVM-rbf和1D-CNN四種機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)預(yù)處理后，幾乎所有模型的分類準(zhǔn)確率都達(dá)到了100%。然而，本研究存在一個(gè)局限性：缺乏在實(shí)際低濃度環(huán)境中的驗(yàn)證，目前僅依賴于測(cè)試集進(jìn)行評(píng)估。未來(lái)研究將納入更多不同來(lái)源和環(huán)境的外部數(shù)據(jù)集，以減少選擇偏差，更全面地評(píng)估模型性能。

論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136963

來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~占英。