機(jī)器視覺增強(qiáng)的Argonaute熒光傳感器：一種簡(jiǎn)化的食品中活沙門氏菌檢測(cè)方法
發(fā)布時(shí)間：2025-04-07 瀏覽次數(shù)：113
1. 引言
多菌靈（CBZ）是一種有效的農(nóng)業(yè)殺菌劑，但其過度使用導(dǎo)致農(nóng)藥殘留在環(huán)境和食品中積累，從而對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。因此，開發(fā)簡(jiǎn)單、快速和靈敏的檢測(cè)方法顯得尤為重要。電化學(xué)傳感技術(shù)因其快速、簡(jiǎn)便和高靈敏度而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)。電化學(xué)傳感器的靈敏度主要依賴于電極材料的催化性能。近年來，金屬有機(jī)框架（MOF）衍生的多孔碳材料因其良好的導(dǎo)電性和高比表面積而受到關(guān)注。然而，這些材料的微孔結(jié)構(gòu)限制了金屬催化位點(diǎn)的利用率，提高活性位點(diǎn)的暴露率是提升催化活性的關(guān)鍵。
本研究報(bào)道了一種通過一步熱解策略合成具有大孔壁、集成CoS和CoFe多摻雜納米顆粒的中空泡沫碳（CoS-FeCo-HSNC）。該方法使用ZnCo-MOF作為犧牲模板，CdS納米顆粒作為介孔引發(fā)劑，鐵離子作為開壁大孔引發(fā)劑。熱解過程中，Zn和Cd揮發(fā)形成中空介孔結(jié)構(gòu)，而殘余硫促進(jìn)了CoS的形成。鐵離子融合到碳骨架中，將封閉壁轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放大孔，形成Fe-N活性位點(diǎn)。這種開放壁結(jié)構(gòu)的分層多孔泡沫碳集成了多種活性成分，提供了高效的電子傳遞途徑和活性位點(diǎn)的局部可達(dá)性。最終，將制備的層次化多孔CoS-FeCo-HSNC作為檢測(cè)蔬菜和水果中CBZ的電化學(xué)傳感平臺(tái)。
方案1. 用于檢測(cè)活鼠傷寒沙門氏菌的AFPAM生物傳感器示意圖，無(wú)需復(fù)雜的DNA提取和擴(kuò)增程序。(A)用于鼠傷寒沙門氏菌檢測(cè)的AFPAM生物傳感器示意圖。(B)機(jī)器視覺和機(jī)器學(xué)習(xí)介導(dǎo)的圖像處理和數(shù)據(jù)分析。刻度為0.2 mm。
2. 結(jié)果與討論
AFPAM生物傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌檢測(cè)的主要證明及表征
本研究開發(fā)了一種機(jī)器視覺和學(xué)習(xí)輔助的噬菌體與CbAgo介導(dǎo)的熒光生物傳感器，用于檢測(cè)活的鼠傷寒沙門氏菌。該方法利用羧酸磁性納米顆粒（MNPs）與噬菌體形成的偶聯(lián)物，從食物中快速分離活菌。然后使用RIPA裂解緩沖液釋放DNA，并通過CbAgo與特定gDNA結(jié)合，靶向切割熒光探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光探針被富集在鏈霉親和素修飾的PS微球上，通過機(jī)器視覺算法識(shí)別熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。這種方法無(wú)需復(fù)雜的DNA提取和擴(kuò)增程序，具有高靈敏度和特異性。
熒光信號(hào)集成在單個(gè)毫米微球的表面，利用鏈霉親和素修飾的聚苯乙烯（PS）微球作為熒光信號(hào)富集載體。通過將鏈霉親和素偶聯(lián)于羧基PS微球表面，制備了PS0.5 mm-SA和PS1 mm-SA微球。在相同熒光探針濃度下，PS0.5 mm-SA的熒光更強(qiáng)、更集中，因此被選用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PS0.5 mm-SA與生物素化探針結(jié)合，形成復(fù)合物，在激發(fā)光下發(fā)出熒光信號(hào)。這些信號(hào)通過倒置熒光顯微鏡捕捉，并使用機(jī)器視覺算法識(shí)別熒光強(qiáng)度，獲得相應(yīng)的信號(hào)特征值。
圖1. AFPAM生物傳感器中CbAgo靶向切割特性驗(yàn)證圖及納米顆粒表征。
基于機(jī)器視覺和學(xué)習(xí)的PS微球信號(hào)讀出系統(tǒng)原理
本研究的機(jī)器視覺和學(xué)習(xí)算法處理圖像的工作流程主要包括兩部分：基于機(jī)器視覺的熒光信號(hào)采集和轉(zhuǎn)換，以及基于機(jī)器學(xué)習(xí)的彈性網(wǎng)絡(luò)回歸模型。通過將熒光信號(hào)整合到毫米微球上，消除了傳統(tǒng)顯微成像的視野損失，提高了檢測(cè)靈敏度。采用雙邊濾波和自適應(yīng)閾值分割算法處理熒光圖像，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度以減少局部異常光點(diǎn)的影響。彈性網(wǎng)絡(luò)回歸模型建立了微球平均熒光強(qiáng)度與鼠傷寒沙門氏菌濃度之間的線性關(guān)系，表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確性和魯棒性。這種方法在食品樣品中檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌時(shí)不需要復(fù)雜的DNA提取和擴(kuò)增程序。
圖2. 基于機(jī)器視覺的AFPAM生物傳感器PS微球信號(hào)讀出系統(tǒng)。
AFPAM生物傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的靈敏度研究
AFPAM生物傳感器在優(yōu)化條件下檢測(cè)不同鼠傷寒沙門氏菌濃度的靈敏度進(jìn)行了評(píng)估。熒光信號(hào)通過生物素-親和素相互作用在單個(gè)PS0.5 mm-SA微球上富集，隨著鼠傷寒沙門氏菌濃度增加，熒光強(qiáng)度呈線性增加（R2 = 0.99）。檢測(cè)限（LOD）為40.5 CFU/mL，與傳統(tǒng)方法相比，AFPAM生物傳感器無(wú)需DNA擴(kuò)增，靈敏度提高約15倍。與qPCR方法相比，AFPAM傳感器能夠區(qū)分活菌和非活菌，避免假陽(yáng)性結(jié)果。該方法簡(jiǎn)化了DNA提取過程，提高了檢測(cè)效率。
圖3. AFPAM生物傳感器分析性能圖。
AFPAM生物傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的特異性研究
AFPAM生物傳感器的高特異性是其有效性的關(guān)鍵組成部分。該傳感器利用噬菌體LPST10特異性識(shí)別活的鼠傷寒沙門氏菌，并通過特定引物與CbAgo蛋白的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)靶向切割熒光探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅鼠傷寒沙門氏菌DNA與引物匹配時(shí)才會(huì)產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，其他致病菌的DNA產(chǎn)生的信號(hào)與空白對(duì)照幾乎一致。這證明了AFPAM傳感器的高選擇性。
在實(shí)際樣品檢測(cè)中，AFPAM傳感器能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)食品樣品中的鼠傷寒沙門氏菌，平均回收率在93.22% ~ 106.02%之間。與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法和qPCR法相比，AFPAM傳感器的檢測(cè)結(jié)果具有更好的一致性（R2 = 0.96和0.97）。這種方法無(wú)需復(fù)雜的DNA提取和擴(kuò)增步驟，僅需3小時(shí)即可完成定量檢測(cè)，靈敏度高于qPCR。然而，AFPAM傳感器目前不適合高通量檢測(cè)，需要進(jìn)一步改進(jìn)以適應(yīng)大規(guī)模應(yīng)用。
圖4. 利用AFPAM生物傳感器、平板計(jì)數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)qPCR法對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的特異性和真實(shí)樣品進(jìn)行分析。
3. 總結(jié)
本研究設(shè)計(jì)了一種創(chuàng)新的機(jī)器視覺和學(xué)習(xí)介導(dǎo)的噬菌體與基于CbAgo的AFPAM生物傳感器，用于快速、簡(jiǎn)單和高靈敏度地檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌。這種方法無(wú)需復(fù)雜的DNA提取和擴(kuò)增程序，利用噬菌體特異性鑒定活鼠傷寒沙門氏菌，并通過RIPA裂解緩沖液釋放其DNA。CbAgo的獨(dú)特裂解活性使其能夠在gDNA的引導(dǎo)下對(duì)雙鏈和單鏈DNA進(jìn)行靶向裂解，在室溫下具有較高的裂解活性。AFPAM生物傳感器采用鏈霉親和素修飾的單個(gè)聚苯乙烯（PS）微球作為最終測(cè)定單元，可以特異性富集生物素化熒光信號(hào)探針，從而顯著提高靈敏度。這種方法避免了傳統(tǒng)PCR方法中的DNA擴(kuò)增步驟，使其相對(duì)于大多數(shù)現(xiàn)有熒光傳感器具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，該方法采用機(jī)器視覺算法進(jìn)行信號(hào)處理，將熒光微球的信號(hào)值轉(zhuǎn)換為平均熒光強(qiáng)度，消除微球表面異常亮斑的影響。所提出的AFPAM生物傳感器成功地提供了準(zhǔn)確和高靈敏度的定量食品和環(huán)境樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.133648
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~占英。
