牛奶樣品中金黃色葡萄球菌測試片確認片效果評價（參照 GB4789.10—2016）
發(fā)布時間：2022-05-05 瀏覽次數(shù)：257
一、實驗?zāi)康?/span>
將牛奶增菌液分別在 BHK 金黃色葡萄球菌測試片、3M 金黃色葡萄球菌測試片和 Baird-Parker 平板上劃線分離，對分離出的可疑菌落用金黃色葡萄球菌確認反應(yīng)片進行確認以及生化鑒定等。觀察 BHK 金黃色葡萄球菌測試片、3M 金黃色葡萄球菌測試片和 Baird-Parker 之間，BHK 和 3M 確認反應(yīng)片之間的效果。
二、實驗樣品
增菌液（編號：4292、3469、3417、2578、2917、2436、2145 和 2094）；牛奶樣品（編號：2094-1、2094-2、2578）。
三、實驗操作
1、牛奶樣品增菌
取 1mL 混勻的牛奶樣品（編號：2094-1、2094-2、2578）至 9mL 的 7.5%氯化鈉肉湯試管中渦旋混勻。
2、培養(yǎng)
將上述樣品勻液于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18h~24h。最終呈混濁生長。
3、分離
1）將增菌后的培養(yǎng)物，分別劃線接種到 BHK 金黃色葡萄球菌測試片、3M 金黃色葡萄球菌測試片和Baird-Parker平板上，測試片36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~24h，Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24h~48h。
2）將 BHK 金黃色葡萄球菌測試片上可疑金黃色葡萄球菌菌落，用 1μL 接種環(huán)或接種針挑取劃線至血平板上 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18h~24h。
4、初步鑒定
1）金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、菌落， 顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶。
2）在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見完全透明溶血圈。
3）對于 BHK 金黃色葡萄球菌測試片、3M 金黃色葡萄球菌測試片上分離出的可疑金黃色葡萄球菌菌落為品紅-紫紅色菌落，用各自配套的金黃色葡萄球菌確認反應(yīng)片進行確認。BHK 金黃色葡萄球菌測試片加入確認反應(yīng)片后 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 4?6h；3M 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 3?4h。
加入確認片后 BHK 上金葡表現(xiàn)為品紅色菌落變成藍紫色菌落；3M 上表現(xiàn)為紫紅色菌落周圍有粉色暈圈。BHK 無明顯顏色變化和 3M 菌落周圍無粉色暈圈則判定不是金黃色葡萄球菌。
5、確證鑒定
1）革蘭氏染色：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為 0.5μm~1μm。
2）血漿凝固酶試驗：挑取 Baird-Parker 平板或血平板上至少 5 個可疑菌落(小 于 5 個全選)，分別接種到 5mLBHI 肉湯中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18h?24h。將凍干血漿先用 0.5mL 生理鹽水溶解，再加入 BHI 培養(yǎng)物 0.3 mL，振蕩搖勻，置 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)箱箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察 6h，如呈現(xiàn)凝固(即將西林瓶傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。
3）氧化酶和觸酶試驗
氧化酶：挑取血平板上分離出的可疑單菌落于氧化酶試紙表面，觀察試紙的顏色，陽性為紫紅色或紅色，陰性為不變色。
觸酶（載玻片法）：用接種環(huán)挑取血平板上分離出的可疑單菌落至干凈的載玻片上，加一滴 3%?30%過氧化氫于載玻片的細菌上，即可觀察氣泡的產(chǎn)生，若產(chǎn)生氣泡為陽性。金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為氧化酶陰性，觸酶陽性。
4）熒光探針法（金黃色葡萄球菌 PCR 檢測試劑盒）
從血平板上挑取可疑菌落，充分懸浮于預(yù)先加有 30μL 裂解液的無菌離心管中，輕彈管壁消除氣泡，99℃熱裂解 10min。12000r/min 離心 5 分鐘，上清液即為粗提的 DNA。
按照需求取 n 個 PCR 反應(yīng)管（n=1 管陰性對照+待檢測樣品數(shù)+1 管陽性對照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入 16μL 預(yù)混液，待用。向上述 n 個反應(yīng)管中分別加入陰性對照、 待測樣品 DNA、陽性對照各 4 μL，蓋緊管蓋，短暫離心，立即進行 PCR 擴增反應(yīng)。
結(jié)果判讀： Ct 值≤35 金黃色葡萄球菌陽性；若 Ct 值≥37，則金黃色葡萄球菌陰性。
四、實驗結(jié)果與分析
1、4292、3469 在 Baird-Parker 平板上為陽性，其它為陰性；3469、2917、2436、 2145、2578、2094-1、2094-2 在測試片和 3M 上均為陽性，其它為陰性。
| 樣品編號 | BHK | BHK | Baird-Parker |
| 4292 | -藍綠色菌落 | -黑色菌落 | +黑色菌落，周圍有水解圈 |
| 3469 | +品紅色菌落 | +紫紅色和藍 綠色菌落 | +黑色菌落，周圍有水解圈 |
| 3417 | -無 | -無 | -灰白色菌落 |
| 2578 | -無 | -無 | -無 |
| 2917 | +品紅色菌落 | +紫紅色菌落 | -黑色菌落，周圍無水解圈 |
| 2436 | +品紅色菌落 | +紫紅色菌落 | -黑色菌落，周圍無水解圈 |
| 2145 | +品紅色菌落 | +紫紅色菌落 | -黑色菌落，周圍無水解圈 |
| 2094 | -無 | -無 | -黑色菌落，周圍無水解圈 |
| 2578 牛奶樣品 | +品紅色菌落 | +紫紅色和藍 綠色菌落 | -黑色菌落，周圍無水解圈 |
| 2094-1 牛奶樣品 | +品紅色菌落 | +紫紅色和藍 綠色菌落 | -黑色菌落，周圍無水解圈 |
| 2094-2 牛奶樣品 | +品紅色菌落 | +紫紅色和藍 綠色菌落 | -黑色菌落，周圍無水解圈 |
2、3469、2917、2436、2145、2578、2094-1、2094-2 測試片上分離到的疑似陽性菌經(jīng)初步確認為金黃色葡萄球菌，在 baird-parker 上顯陽性的 4292 經(jīng)確認為陰性。
| 樣品編號 | BHK確認片 | 3M確認片 | 血平板 | 血漿凝固酶 | 氧化酶 | 觸酶 | 革蘭氏染色 |
| 4292 | / | / | / | - | - | + | G+球菌 |
| 3469 | +藍紫色 | +粉紅色 | β溶血 | + | - | + | G+球菌 |
| 2917 | +藍紫色 | +粉紅色 | β溶血 | + | - | + | G+球菌 |
| 2436 | +藍紫色 | +粉紅色 | β溶血 | + | - | + | G+球菌 |
| 2145 | +藍紫色 | +粉紅色 | β溶血 | + | - | + | G+球菌 |
| 2578 | +藍紫色 | +粉紅色 | β溶血 | + | - | + | G+球菌 |
| 2094-1 | +藍紫色 | +粉紅色 | β溶血 | + | - | + | G+球菌 |
| 2094-2 | +藍紫色 | +粉紅色 | β溶血 | + | - | + | G+球菌 |
3、經(jīng)金黃色葡萄球菌 PCR 檢測試劑盒（熒光探針法）確認，3469、2917、2436、 2145、2094-1、2094-2、2578 樣品均為金黃色葡萄球菌，與測試片確認片的結(jié)果一致。
| 樣品編號 | CT 值 | 結(jié)果判定 |
| NG（陰性對照） | Undeter | Undeter |
| PS（陽性對照） | 23.49 | + |
| 3469-2 | 16.725 | + |
| 2917 | 19.970 | + |
| 2436 | 17.677 | + |
| 2145 | 15.706 | + |
| 2094-1 牛奶樣品 | 17.617 | + |
| 2094-2 牛奶樣品 | 17.692 | + |
| 2578 牛奶樣品 | 17.234 | + |
五、結(jié)論
本實驗證明 BHK 金黃色葡萄球菌測試片、確認反應(yīng)片和 3M 金黃色葡萄球菌測試片、確認反應(yīng)片效果無明顯差異。實驗中 Baird-Parker 平板存在假陽性（4292）以及假陰性（3469-2、2917、2436、2145、2094-1 牛奶樣品、2094-2牛奶樣品和 2578 牛奶樣品）。BHK 金黃色葡萄球菌測試片和確認片對實際樣品的分離效果良好。
附件 1 樣品在 BHK 測試片、3M 測試片和 Baird-parker 上的初步分離結(jié)果
附件 2 分離菌的確認片鑒定結(jié)果
附件 3 分離菌的分子鑒定結(jié)果（請下載附件查閱詳細資料?。?/span>
