產(chǎn)品名稱：pSumo Expression Kit
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價格 |
| HKV105-01A | pSumo Expression Kit | 1μg/20次 | 表達載體 | 960 |
產(chǎn)品描述：
pSumo 專為目標蛋白在大腸桿菌中可溶性表達設(shè)計是預(yù)先用 Xho I，Sal I 線性化的載體，請配合 Plus PCR 一步定向克隆試劑盒（Cat.No：HKNR005）使用。外源蛋白在大腸桿菌中表達容易形成包涵體，使獲得有生物學活性的蛋白比較困難。常見表達載體往往由于蛋白表達過快，目標蛋白來不及正確折疊而形成包涵體。該質(zhì)粒使用于阿拉伯糖誘導(dǎo)，有較強的劑量依賴性。合適的阿拉伯糖濃度能夠在保障表達效率的同時獲得高效的可溶蛋白。SUMO 融合標簽可有效促進目標蛋白的正確折疊，從而提高蛋白質(zhì)的可溶性，同時 SUMO Protease（Cat.No：HKPE002）是一種結(jié)構(gòu)特異性的蛋白酶，只切割有正確構(gòu)象的融合蛋白，因而可以準確移除融合標簽。
目的基因擴增按常規(guī)方法設(shè)計引物后，在上游引物 5′端前添加以下序列： CA GAT TGG AGG TCT CGA GATG；下游引物 5′ 端前添加：GAT GAT GAT GAT GAT GGT CGAC。
注意：5′端引物從第一個氨基酸不是甲硫氨酸 (ATG) 時，可使用 GAA CAG ATT GGA GGT。不希望目標蛋白 C 端保留 His Tag 時 3′端引物需要加入終止密碼子。
產(chǎn)品特點：
SUMO 融合標簽可有效促進目標蛋白的正確折疊，提高蛋白質(zhì)的可溶性。
SUMO Protease 是一種結(jié)構(gòu)特異性的蛋白酶，準確去除融合標簽。
Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡便，完成質(zhì)粒構(gòu)建。
應(yīng)用實例：圖例）pSumo 載體促進融合蛋白表達。
泳道 1：誘導(dǎo)前；
泳道 2：誘導(dǎo)后；
泳道 M：Protein Marker。
保存溫度：-20℃
pSumo Expression Kit 產(chǎn)品包裝（A包裝）：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| pSumo（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| SUMO Protease（1U/μl） | 100μl |
質(zhì)量保證：pSumo 線性化載體經(jīng)過嚴格的自連測試 以及連接效率測試，滿足下游實驗需求。
注意事項：
1）目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化，避免引物二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2：1。
3）引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR擴增的保真度，請盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast Pfu DNA 聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長度至少在 40- 45bp，包括 5'端與載體同源的 20bp 序列以及目的片段特異性20-25bp 序列。
（注意：如果是表達載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計完成后，請注意 檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化（我們建議所使用的感受態(tài)細胞效率要大于5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細胞，輕彈管壁使細胞重懸起來。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細胞中，用移液 槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達，菌體復(fù)蘇。
4，吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測，利用高速 PCR 擴增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進行菌落 PCR 鑒定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結(jié)果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。
pSumo 結(jié)構(gòu)圖：
| pBAD promoter | 3 - 277 |
| SUMO fusion Tag | 319 - 642 |
| rrnB Terminator | 711 - 1136 |
| Amp resistance | 1229 - 2089 |
| Pbr322 Ori | 2234 - 2907 |
| AraC CDS | 3438 - 4340 |
