根據(jù)《食品安全法》規(guī)定，國家衛(wèi)生健康委、市場監(jiān)管總局聯(lián)合印發(fā)2025年第2號公告，發(fā)布50項(xiàng)新食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)和9項(xiàng)修改單。其中微生物部分的標(biāo)準(zhǔn)包括：

（1）GB 4789.3《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（修訂）
（2）GB 4789.38《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》（修訂）
（3）GB 4789.30《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（修訂）
（4）GB 4789.42《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》 （修訂）
（5）GB 31615.2《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品用菌種安全性評價(jià)程序》（制定）

本文旨在通過對比2025版與2016版大腸菌群檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，清晰闡述修訂的關(guān)鍵變更與發(fā)展趨勢，以期幫助相關(guān)從業(yè)人員深入理解并掌握食品檢驗(yàn)領(lǐng)域最新動(dòng)向。該標(biāo)準(zhǔn)將取代GB4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》，其修訂主要體現(xiàn)在五個(gè)方面。

1. 增加檢測方法選擇性（如均質(zhì)器應(yīng)用）
2. 完善特殊品類檢測方案（乳制品專項(xiàng)）
3. 構(gòu)建分級判定體系（典型/非典型菌落）
4. 建立容錯(cuò)處理機(jī)制（空白對照異常）
5. 強(qiáng)化標(biāo)準(zhǔn)可操作性（新增示例說明）

一、變化亮點(diǎn)

1、標(biāo)準(zhǔn)框架調(diào)整

a. 檢驗(yàn)原理修訂
? 刪除原版“檢驗(yàn)原理”章節(jié)
? 保留MPN法（最可能數(shù)法）原理說明
? 移除平板計(jì)數(shù)法原理描述

2、術(shù)語體系優(yōu)化

? 細(xì)化“大腸菌群”等核心術(shù)語定義
? 刪除"最可能數(shù)（MPN）基于泊松分布..."的數(shù)學(xué)理論描述
? 強(qiáng)化操作相關(guān)術(shù)語的實(shí)踐指導(dǎo)性

3、實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料更新

a. 新增設(shè)備要求
? 30±1℃恒溫培養(yǎng)箱（針對乳制品檢測）
? 無菌接種環(huán)、無菌試管等耗材
? 大腸菌群計(jì)數(shù)測試片（4.8條款新增）

b. 設(shè)備參數(shù)調(diào)整
? 水浴箱溫度由“46±1℃”擴(kuò)展為“48±2℃”
? 取消菌落計(jì)數(shù)器的強(qiáng)制配備要求

4、檢測流程優(yōu)化

a. 培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整
? BGLB肉湯培養(yǎng)時(shí)限由48±2h改為24-48h
? 復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)建立24h/48h雙觀察節(jié)點(diǎn)

b. 操作方法改進(jìn)
? 液體樣品增加均質(zhì)器振搖選項(xiàng)；
? 取消稀釋過程"換用吸管吹打"的硬性規(guī)定；
? 規(guī)范初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)操作表述。

5、大腸菌群平板法接種與培養(yǎng)的修改

a. 培養(yǎng)基處理
? 培養(yǎng)基保溫溫度同步調(diào)整為48±2℃

b. 乳制品檢測規(guī)范
? 明確乳制品采用30±1℃培養(yǎng)（18-24h）
? 基于研究數(shù)據(jù)佐證溫度調(diào)整的科學(xué)性

c. 菌落判定標(biāo)準(zhǔn)
? 細(xì)化典型/非典型菌落形態(tài)學(xué)特征
? 新增15-150CFU雙稀釋度處理規(guī)則（參照附錄D）

6、結(jié)果處理更完善

a. 計(jì)算規(guī)則
? 細(xì)化空白對照異常處理方案
? 新增多場景計(jì)算結(jié)果修約規(guī)范

b. 報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)化
? 增加示例說明不同檢測情形的報(bào)告方式
? 強(qiáng)化與附錄D的協(xié)同應(yīng)用機(jī)制

二、詳細(xì)對比

1、范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群(Coliforms)計(jì)數(shù)的方法。 
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)，第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。

2、術(shù)語和定義

2.1 大腸菌群 Coliforms

在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

2.2 MPN法 Most Probable Number(MPN) Technique（替換最可能數(shù)）

MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后，根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最可能數(shù)。

(原標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容)

最可能數(shù) Mostprobablenumber;MPN2.2
基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。

(刪除了以下內(nèi)容)

3、檢驗(yàn)原理

3.1  MPN 法
MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后，根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。3.2  平板計(jì)數(shù)法大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。

3.2  平板計(jì)數(shù)法
大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。

3、設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ ±1 ℃、30 ℃ ±1 ℃（新增）。 
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃ 。 
3.3 恒溫水浴箱：48 ℃±2 ℃ 。（原標(biāo)準(zhǔn)46 ℃±1 ℃） 
3.4 天平：感量 0.1 g。
3.5 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯，振蕩器。 
3.6 無菌試管：15 mm×150 mm、18 mm×100 mm 或其他合適規(guī)格，以及小倒管（杜氏管）。（新增）
3.7 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、2 mL（具 0.02 mL 刻度）（新增）、5mL（具 0.05 mL刻度）（新增）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及無菌吸頭。 
3.8 無菌錐形瓶：容量 500 mL。 
3.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。 
3.10 pH 計(jì)或精密 pH 試紙。 
3.11 無菌接種環(huán)：10 μL（直徑約 3 mm）。（新增）
3.12 放大鏡（新增）或菌落計(jì)數(shù)器

4、培養(yǎng)基和試劑

4.1 磷酸鹽緩沖液：見 A.1。（原標(biāo)準(zhǔn)無菌磷酸鹽緩沖液）
4.2 生理鹽水：見 A.2。（原標(biāo)準(zhǔn)無菌生理鹽水）
4.3 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯：見 A.3。
4.4 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯：見 A.4。
4.5 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）：見 A.5。
4.6 1 mol/L NaOH：見 A.6。
4.7 1 mol/L HCl：見 A.7。
4.8 大腸菌群計(jì)數(shù)測試片(應(yīng)以發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣為陽性結(jié)果判斷依據(jù)，且性能符合GB4789.28中相關(guān)培養(yǎng)基的質(zhì)量要求)。 （新增）

第一法 大腸菌群MPN 計(jì)數(shù)法

5、檢驗(yàn)程序

大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1。

圖1 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序

主要修改點(diǎn)為BGLB肉湯培養(yǎng)時(shí)間由48 h±1 h改為24h~48h。

6、操作步驟

6.1 樣品的稀釋

6.1.1 固體和半固體樣品：無菌操作稱取 25 g 樣品，放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/min～10 000 r/min 均質(zhì) 1 min～2 min；或放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的樣品勻液。

6.1.2 液體樣品：用無菌吸管吸取 25 mL 樣品置于盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠），或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成 1∶10的樣品勻液。當(dāng)樣品不適宜進(jìn)行體積取樣時(shí)，按6.1.1操作。

6.1.3 必要時(shí)用 1 mol/L NaOH或 1 mol/LHCl，調(diào)節(jié)樣品勻液的pH至6.5～7.5 之間。(調(diào)整了文字順序，原標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容樣品勻液的pH應(yīng)在6.5~7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/L NaOH 或1mol/L HCl調(diào)節(jié)。)

6.1.4 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩緩注入裝有 9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），將試管在振蕩器上振蕩混勻或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。

6.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，參照6.1.4的操作，依次制成 10 倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1 次，換用 1 支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min。

6.2 初發(fā)酵試驗(yàn)

6.2.1 每個(gè)樣品，選擇 3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種 3 管 LST 肉湯，每管接種 1mL（如接種量超過 1 mL，則用雙料 LST 肉湯）。從制備樣品勻液開始至接種到 LST肉湯完畢，全過程不得超過15min。
將已接種樣品的LST肉湯管置于 36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，檢查產(chǎn)氣情況。24h±2h小倒管或產(chǎn)氣收集裝置內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，或輕輕振搖 LST肉湯管可見試管內(nèi)有細(xì)密氣泡不斷上升者，判斷為產(chǎn)氣，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(確認(rèn)試驗(yàn))。如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h再檢查產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn);培養(yǎng)至48h±2h，仍未產(chǎn)氣者判斷為大腸菌群陰性。若培養(yǎng)至 48h±2h，所有 LST肉湯管均未產(chǎn)氣，按照附錄 B中的 MPN檢索表，報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸菌群的 MPN值，以 MPN/g(mL)表示 。

6.3  復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(確認(rèn)試驗(yàn))(原標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)試驗(yàn))

輕輕振搖各產(chǎn)氣的LST肉湯管，分別用接種環(huán)取培養(yǎng)物1環(huán)，轉(zhuǎn)種于BGLB肉湯管中，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，檢查產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者判斷為大腸菌群陽性；未產(chǎn)氣者則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h再檢查產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者判斷為大腸菌群陽性，仍未產(chǎn)氣者判斷為大腸菌群陰性。（原標(biāo)準(zhǔn)36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。)

7、結(jié)果與報(bào)告（原標(biāo)準(zhǔn)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的報(bào)告）

根據(jù)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)中3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度中大腸菌群陽性的管數(shù)(如連續(xù)的稀釋度超過3個(gè)，根據(jù)附錄C確定最適的3個(gè)連續(xù)稀釋度)，按照附錄B中的MPN檢索表，報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸菌群的MPN值，以MPN/g(mL)表示。（原標(biāo)準(zhǔn)按7.3確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù)，檢索MPN 表(見附錄B)，報(bào)告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN 值。)

第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法

8、檢驗(yàn)程序

大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖 2。

圖2 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序

檢驗(yàn)程序主要修改點(diǎn)為新增大腸菌群測試片及新增乳及乳制品的培養(yǎng)溫度要求。

9、操作步驟

9.1 樣品的稀釋

按 6.1 進(jìn)行。

9.2 接種與培養(yǎng)

9.2.1 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選取 2個(gè)~3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液) ，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌培養(yǎng)皿，每皿1mL。同時(shí)取磷酸鹽緩沖液或生理鹽水加入2個(gè)無菌培養(yǎng)皿作空白對照，每皿1mL。（原標(biāo)準(zhǔn)取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照）

9.2.2 盡快將冷卻至48 ℃±2℃的 VRBA傾水平靜置待其凝固。從制備樣品勻液開始至傾注VRBA完畢，全過程不得超過15min。瓊脂凝固后，再均勻覆蓋3m~4VRBA至整個(gè)平板表面。覆層的瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。對于乳及乳制品應(yīng)置于30℃+1℃培養(yǎng)18h~24h。（原標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)將15mL~20mL融化并恒溫至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿（避免搖出培養(yǎng)基），將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。）

9.2.3 若采用大腸菌群計(jì)數(shù)測試片，則按其說明進(jìn)行操作。（新增）

9.3 平板菌落數(shù)的選擇

9.3.1 觀察并計(jì)數(shù)菌落，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器。選取所有菌落數(shù)在15CFU~150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紅色至紫紅色，菌落周圍可帶有紅色沉淀環(huán)，菌落直徑一般大于0.5mm?？梢删錇榧t色至紫紅色，菌落直徑一般小于0.5mm。（原標(biāo)準(zhǔn)典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大，最低稀釋度平板低于15CFU 的記錄具體菌落數(shù)。）

9.3.2 若有2個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在15CFU~150CFU之間以及其他情形的菌落數(shù)選擇，按附錄D的規(guī)定執(zhí)行。（新增）

9.4 確認(rèn)試驗(yàn)（原標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)試驗(yàn)）

從同一稀釋度的 VRBA平板上挑取典型和可疑菌落各5個(gè)，典型或可疑菌落少于5個(gè)者，則挑取其全部菌落。每個(gè)菌落接種1支BGLB肉湯管，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，檢查產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者為大腸菌群陽性;未產(chǎn)氣者則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h再觀察，產(chǎn)氣者為大腸菌群陽性，仍未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。
（原標(biāo)準(zhǔn)從VRBA 平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，少于10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。）

10、結(jié)果計(jì)算與報(bào)告 

10.1 所選稀釋度的典型菌落數(shù)以及可疑菌落數(shù)與各自大腸菌群陽性率的乘積之和的平均值，乘以稀釋倍數(shù)，為大腸菌群的菌落數(shù)。大腸菌群的菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”的原則修約，以整數(shù)報(bào)告。大腸菌群的菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，保留兩位有效數(shù)字。附錄D規(guī)定了大腸菌群菌落數(shù)的計(jì)算、數(shù)值修約和結(jié)果報(bào)告的方式，并給出了相關(guān)示例。

10.2 若空白對照上有菌落生長，則此次檢驗(yàn)結(jié)果無效。

10.3 稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告結(jié)果，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告結(jié)果。

（原標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以9.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10^-4樣品稀釋液1mL，在VRBA 平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×10⁴/g(mL)=6.0×10⁵CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。）

來源：“食品微生物檢測”公眾號，作者~食品微生物檢測！
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