原創(chuàng) | 一文讀懂芽孢染色法：揭秘細(xì)菌的“休眠密碼”
發(fā)布時(shí)間：2025-04-16 瀏覽次數(shù)：188
在微生物的世界里，細(xì)菌的芽孢堪稱(chēng)“生存大師”。當(dāng)環(huán)境惡化時(shí)，它們會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)，形成厚壁的芽孢，抵抗高溫、干旱甚至化學(xué)消毒劑的侵襲。如何讓這些微小的“防護(hù)罩”在顯微鏡下現(xiàn)形？芽孢染色法正是解開(kāi)這一謎題的關(guān)鍵技術(shù)。本文將從原理到實(shí)操，帶你全面了解這項(xiàng)微生物學(xué)經(jīng)典技術(shù)。
一、芽孢染色法的核心原理
芽孢的特殊結(jié)構(gòu)是其難以被常規(guī)染色法觀察的原因。芽孢壁由多層致密的蛋白質(zhì)和鈣質(zhì)組成，透性極低，普通染料難以滲透。芽孢染色法通過(guò)以下策略突破這一難題：
1、加熱促滲：使用弱堿性染料（如孔雀綠）并加熱，促使染料穿透芽孢壁。
2、差異脫色：染色后水洗，菌體中的染料被洗脫，而芽孢因結(jié)構(gòu)致密保留顏色。
3、對(duì)比復(fù)染：用番紅等復(fù)染劑對(duì)菌體二次染色，最終芽孢呈綠色，菌體呈紅色，形成鮮明對(duì)比。
注：芽胞具有高度的折光性，外膜致密，滲透性低，故普通染色法不易使其著色，芽胞染色法是根據(jù)芽胞既難以著色，而一旦著色又難以脫色的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的。所有芽胞染色法都基于同一個(gè)原則：采用著色力強(qiáng)的染料，并加熱以促進(jìn)標(biāo)本著色，然后使菌體脫色，而芽胞上的染料仍保留，經(jīng)復(fù)染后，菌體和芽胞呈現(xiàn)不同的顏色。
二、實(shí)驗(yàn)操作全流程（以Schaeffer-Fulton法為例）
材料準(zhǔn)備：枯草芽孢桿菌、5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅染液、載玻片、酒精燈、顯微鏡等。
步驟詳解：
1、涂片固定：取潔凈的載玻片，在載玻片上滴加一滴生理鹽水，然后用接種環(huán)蘸取少量芽孢菌跟水混勻，晾干，用酒精燈固定。
2、初染加熱：將固定好的涂片放入含5%孔雀綠水溶液的50℃水浴染色缸中，浸染15min，如下圖2-1?；蛘咴谕科系渭涌兹妇G，酒精燈加熱至冒蒸汽并維持5分鐘（需補(bǔ)液防干燥），如下圖2-2。
3、水洗脫色：取出載玻片，用水沖洗多余染液，直至出水無(wú)色為止。
4、復(fù)染顯色：0.5%堿性番紅復(fù)染1min。
5、沖洗：用水沖洗多余染液，直至出水無(wú)色為止，晾干。
6、鏡檢觀察：先低倍鏡找到區(qū)域后，換油鏡觀察芽孢和菌體。菌體呈紅色或粉色，而芽孢呈綠色（如下圖）。
三、常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)
Q1、為何鏡檢中游離芽孢多？
答：可能原因：菌體處于生長(zhǎng)衰退期，芽孢已釋放；培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致菌體裂解。
Q2、染色失敗怎么辦？
答：檢查加熱是否均勻，避免染液蒸干；確保復(fù)染前充分水洗。
&3、關(guān)鍵控制點(diǎn)：
● 無(wú)菌操作防污染，試劑現(xiàn)配現(xiàn)用保效果；
● 脫色時(shí)間不超過(guò)2秒，防止過(guò)度脫色。
四、應(yīng)用場(chǎng)景：從實(shí)驗(yàn)室到產(chǎn)業(yè)一線
1、食品工業(yè)：檢測(cè)罐頭等高溫滅菌食品中是否殘留耐熱芽孢，評(píng)估滅菌效果。
2、臨床診斷：快速鑒別炭疽芽孢桿菌等致病菌，輔助感染診斷。
3、環(huán)境監(jiān)測(cè)：分析土壤或水體中芽孢桿菌的分布，評(píng)估生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。
4、科研分類(lèi)：通過(guò)芽孢形狀（圓形/橢圓形）、位置（中央/末端）等特征進(jìn)行菌種鑒定。
最后，環(huán)凱生物基于芽孢染色技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用場(chǎng)景，現(xiàn)已整理出相應(yīng)產(chǎn)品解決方案供選擇（見(jiàn)以下列表）！
