稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的四大誤區(qū)
發(fā)布時間：2024-10-08 瀏覽次數(shù)：1974
今天要跟大家分享的是一篇關(guān)于平板菌落計(jì)數(shù)的文獻(xiàn)，雖然這篇文章更多的是針對應(yīng)試的，但是個人覺得對于我們在工作和科研實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際操作也是挺有用的。特別是對單位換算，樣品稀釋操作不是很清楚的小伙伴應(yīng)該會有一定幫助。
稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的計(jì)算公式為：
每克樣品中的菌株數(shù) ＝ （Ｃ ÷ Ｖ） × Ｍ，Ｃ 代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，Ｖ 代表涂布平板時所用稀釋液的體積，Ｍ 代表稀釋倍數(shù)。
誤區(qū)1 對平均菌落數(shù)的理解
公式中的 Ｃ 不一定是所有實(shí)驗(yàn)所得菌落數(shù)的平均值。 為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)說服力和減小實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)需設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)。若空白對照有菌，說明實(shí)驗(yàn)可能被污染，相當(dāng)于質(zhì)控不在控，這種情況下不能將平板菌落數(shù)去平均值，而是需要分析可能污染的原因并重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
重復(fù)實(shí)驗(yàn)是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布３個平板（一般設(shè)置３—５ 個平板），選擇菌落數(shù)在 30—300 的平板計(jì)算平均菌落數(shù)。若重復(fù)實(shí)驗(yàn)中某個平板的菌落數(shù)與其他差別甚遠(yuǎn)，如四個平板的菌落數(shù)分別為 42、200、256、234，菌落數(shù)42與其他數(shù)值差異過大，說明該平板操作過程有誤，則該菌落數(shù)應(yīng)舍棄。 若舍棄后不足三個平板，不能用菌落數(shù)相近的兩個平板取平均值，應(yīng)找到原因并重做實(shí)驗(yàn)。 若計(jì)算每克樣品中的某種菌株數(shù)，則 Ｃ應(yīng)代表某一稀釋度下平板上生長的符合該菌菌落特征的菌落數(shù)的平均值，培養(yǎng)基上其他菌種形成的菌落數(shù)不能一并計(jì)算在內(nèi)。 如檢測１L待測水樣中的大腸桿菌數(shù)目只統(tǒng)計(jì)大腸桿菌菌落數(shù)的平均值。
誤區(qū)二 對稀釋倍數(shù)的判定
平板中菌落數(shù)過少會導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差過大，菌落數(shù)過多又會造成計(jì)數(shù)困難，為確保有效活菌數(shù)的準(zhǔn)確測定，應(yīng)合理設(shè)定稀釋倍數(shù)。待測樣品中微生物數(shù)量越多，所需稀釋倍數(shù)越大，而微生物數(shù)量越少，所需稀釋倍數(shù)越小。
如測定土壤中細(xì)菌數(shù)量，一般選用１０４、１０５和 １０６ 倍稀釋；測定放線菌數(shù)量，一般選用１０３、１０４和 １０５倍稀釋；測定真菌數(shù)量，一般選用 １０２、 １０３和 １０４倍稀釋；測定自來水中大腸桿菌數(shù)量，一般不稀釋，直接進(jìn)行涂布培養(yǎng)。
圖源：人教版高中生物教材
誤區(qū)三 對體積與質(zhì)量的單位換算
微生物計(jì)算公式中的 Ｖ 代表涂布平板時所用稀釋液的體積，通常為0.1 ｍＬ，但若待測樣品中微生物數(shù)目較少，接種0.1mL經(jīng)培養(yǎng)后平板上菌落數(shù)達(dá)不到30，可增大接種量（如接種 １ ｍＬ）。
1cm3=1000μＬ=1mL=0.001L
體積和質(zhì)量的換算公式是：體積 ＝ 質(zhì)量÷ 密度（Ｖ ＝ ｍ／ ρ），水的密度是 １ ｇ／ cm3，則質(zhì)量為１g的水的體積是 １ cm3即１ｍＬ。
誤區(qū)四 對統(tǒng)計(jì)誤差的分析
從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的原理分析，運(yùn)用該方法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，因?yàn)闃悠芬话悴灰淄耆稚⒊蓡蝹€細(xì)胞，當(dāng)兩個或多個活細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的過程分析，稀釋倍數(shù)是否合適、涂布是否均勻、培養(yǎng)環(huán)境是否能保證微生物正常生長、計(jì)數(shù)是否存在漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)等情況都會影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 除此之外，還要考慮培養(yǎng)時間對菌落數(shù)目的影響，菌落數(shù)目需要每隔一段時間統(tǒng)計(jì)一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，防止因培養(yǎng)時間不足遺漏菌落的數(shù)目。
知其然，還要知其所以然。
參考文獻(xiàn)：張艷娟,陳兆亮,郭建坤.稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的四大誤區(qū)[J].中學(xué)生理科應(yīng)試,2024,(04):52-53.
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