一種實現(xiàn)魚類過敏原快速檢測的直接快速qPCR
發(fā)布時間：2024-09-02 瀏覽次數(shù)：365
識別肉類和食品中的動物物種對于維持食品安全和質(zhì)量非常重要，特別是對于沒有或不正確標記的動物物種，可能導致食物過敏反應(yīng)，甚至危及生命。嚴格避免含有過敏原的食物是最有效的方法。
食品中魚類過敏原的快速檢測對食品安全至關(guān)重要，為了確保食品中魚源成分的真實性，人們開發(fā)了多種檢測魚類的方法，包括顯微鏡觀察、免疫學方法、紅外光譜和色譜分析。鏡觀察有一個低檢測限，并取決于檢查員的經(jīng)驗和肉組織的完整性。疫方法靈敏、簡便，但在食品加工過程中，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)很容易被破壞，從而影響檢測。紅外光譜技術(shù)對不同的食物種類需要不同的模型，需要大量的工作，且有一定的局限性。色譜分析根據(jù)產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的種類來源，可以檢測到不同的種類，由于產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量變化范圍廣，干擾因素多，色譜分析靈敏度低，容易出現(xiàn)假陽性。與其他檢測技術(shù)相比，基于DNA檢測的PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、不受食品種類限制等優(yōu)點，已成為食品中物種檢測的主流技術(shù)。然而之前的檢測方法存在一些挑戰(zhàn)，如樣品提取繁瑣、耗時。鑒于現(xiàn)有方法的局限性，作者提出了一種新的直接快速qPCR技術(shù)，以便快速、準確地檢測食品中的魚類過敏原。
本文作者對魚類物種及其對應(yīng)的Genbank編號進行分析?；谡婧?8S rDNA基因保守區(qū)設(shè)計引物和探針。使用NCBI BLAST工具評估引物和探針序列的特異性。優(yōu)化qPCR條件，建立反應(yīng)體系。分析來自不同物種樣本的特異性和添加不同濃度魚類到其他肉類混合物的敏感性。在真實食品樣本中進行精密度測試。采用優(yōu)化的核酸釋放劑提取新鮮魚、蝦、牛肉、蟹、羊肉、豬肉、狗、鵝、雞和鴨的總DNA，并進行快速定量PCR檢測。結(jié)果顯示，只有魚類樣品呈現(xiàn)典型的陽性擴增曲線，而其他動物源性物種和空白對照(ddH2O)均為陰性(圖1)，說明直接快速qPCR對魚類具有特異性，不會與其他被測動物物種發(fā)生交叉反應(yīng)。
確定快速qPCR條件，包括使用10μL的多探針qPCR混合物、特定濃度的引物和探針、模板DNA和循環(huán)的反應(yīng)程序。通過不同比例添加魚類到肉類混合物來評估敏感性。分析含魚的實際食品樣本進行精密度測試。通過與傳統(tǒng)核酸提取方法相比較，驗證肉類DNA提取的核酸釋放劑的有效性。
優(yōu)化的直接快速qPCR條件包括62℃的退火溫度和0.25μM的探針濃度。直接快速qPCR具有檢測0.00001%魚類成分的高精確度。在真實食品樣本中，中度陽性和弱陽性樣本的直接快速qPCR方法展示了低于2%的CV值。實驗結(jié)果顯示直接快速qPCR方法對于檢測食品樣本中的魚類成分具有高精確度，所有含有魚的商業(yè)樣本均呈陽性。
本實驗在qPCR中采用了UNG酶抗污染方案，從根本上消除了PCR擴增子導致的假陽性結(jié)果，保證了檢測的準確性。在操作步驟和報告等待時間方面，本研究與先前報道的魚源成分qPCR檢測技術(shù)相比具有顯著優(yōu)勢(圖2)。作為一種新型的快速現(xiàn)場核酸檢測方法，在食品中魚類過敏原的快速現(xiàn)場檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖1
直接快速qPCR檢測特異性。藍色s型擴增曲線為魚的檢測結(jié)果，藍色直線為蝦、牛肉、螃蟹、羊肉、豬肉、狗、鵝、雞、鴨及陰性對照的陰性結(jié)果。黃色s型曲線為內(nèi)參基因的擴增結(jié)果。
圖2直接快速qPCR的靈敏度。
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~魏文杰
