想看懂方法驗證(validation)報告，這些術語必學
發(fā)布時間：2024-08-14 瀏覽次數(shù)：2125
小六前段時間分別跟小伙伴們掰扯完了方法驗證（validation）和方法確認（verification），介紹了國際上主流的方法驗證規(guī)則概況。在上一期快速檢驗方法如何選擇的文章里也提到了“充分的方法驗證”非常重要。最近有小伙伴們后臺留言，許多方法開發(fā)者都會給提供方法驗證報告，但怎么判斷方法算充分驗證呢？
所以接下來小六跟大家一起分享一些充分驗證需要做的實驗要求，但前提是先要學習這些驗證報告中涉及的“參數(shù)術語”，它們都代表什么意思。
所以本期跟大家分享關于ISO16140-2，AOAC通則，GB4789.45中涉及的重點術語和解釋。
Validation
首先，需要了解這幾個驗證通則中涉及的詞匯有哪些？
ISO16140-2:2016
定性驗證主要參數(shù)：配對/非配對、靈敏度、相對檢出限、包容性、排他性等。
定量驗證主要參數(shù)：相對正確度、準確度、定量限、包容性、排他性等。
AOAC驗證通則
定性驗證主要參數(shù)：包容性、排他性、穩(wěn)健性、重復性和再現(xiàn)性等。
定量驗證主要參數(shù)：包容性、排他性、重復性、偏差和穩(wěn)健性等。
GB4789.45驗證通則
定性驗證主要參數(shù)：靈敏度、包容性、排他性等。
定量驗證主要參數(shù)：靈敏度、包容性、排他性、準確度等。
我們在報告里還會經(jīng)?？吹剑簠⒖挤椒?參比方法、食品基質、樣品等術語。
重點術語詳解
1、靈敏度(sensitivity)
待驗證的定性方法從樣品中檢出目標微生物的能力。
靈敏度體現(xiàn)方法對于樣品中極低污染水平(部分檢出水平)的目標微生物的檢出能力，較高污染水平的樣品對于定性方法的驗證并無太大意義。GB4789.45標準用檢出限來表示定性方法的靈敏度。如果驗證時無參考方法，待驗證方法的靈敏度用LOD表示。如果驗證時有參考方法，待驗證方法的靈敏度用RLOD 表示。
小六看到在ISO16140-2中的靈敏度(sensitivity)研究的意思與GB4789.45中不一樣，我們具體來看看！
ISO16140-2中的靈敏度研究的目的是確定參考方法和替代方法之間的靈敏度差異。靈敏度研究采用自然污染樣品和(或)人工污染的樣品。需對不同的類別(categories)和類型(types)的樣品進行測試，用接受限進行評價。接受限(最大可接受的差異)取決于該靈敏度研究屬于配對研究或非配研究和測試類別的數(shù)量。
這個疑問，小六在GB4789.45-2023《食品安全國家標準 微生物檢驗方法驗證通則》實時指南中找到了答案：
國際上微生物檢驗方法驗證中的靈敏度通常指部分檢出水平樣品的陽性符合率。食品安全國家標準微生物檢驗方法沒有參考方法，可以計算陽性率，但是沒有參考的陽性率，無法計算陽性符合率，因此食品安全國家標準微生物檢驗方法無法采用國際上通常使用的靈敏度。
2、包容性(inclusivity)
待驗證方法對目標微生物的檢出能力。
包容性與排他性一起構成特異性。包容性的驗證不添加食品基質，體現(xiàn)了方法單純的對目標微生物的識別能力。
3、排他性(exclusivity)
待驗證方法對非目標微生物的抗干擾能力。
排他性的驗證不添加食品基質，體現(xiàn)了方法單純的不會將非目標微生物錯誤識別為目標微生物的能力。
包容性和排他性不添加食品基質，考核方法對目標微生物純菌的識別能力。
4、檢出限(limit of detection,LOD)
檢出限是指獲得一定概率陽性測試結果時的目標微生物濃度，是可以被檢測但不能準確定量的最小濃度。需要注意的是，檢出限不是檢出與檢不出的界限，而是一定概率檢出時的濃度水平。
例如，LOD95是 95%檢出概率的目標微生物濃度，在此濃度水平仍存在檢不出的概率5%。定性方法檢出限概率一般確定為 50%，即 LOD50。定量方法檢出限概率一般確定為 95%，即LOD95，或簡寫為 LOD。
5、相對檢出限(RLOD)
如果驗證時有參考方法，待驗證方法與參考方法兩者 50%檢出限的比值。ISO 16140-2:2016 中對于 RLOD 要求不高于 1.5。
定義中的檢出概率規(guī)定為“50%”。實際上，不管檢出概率是多少，待驗證方法與參考方法兩者檢出限的比值不變。也就是說，RLOD是待驗證方法與參考方法兩者檢出限(LOD)的比值，不一定非要 50%檢出限的比值。
6、LOD50
定性方法檢出概率為 50%時，樣品中目標微生物的濃度。
LOD50用于在沒有參考方法的情況下確定定性方法的靈敏度。越低的數(shù)值表明定性方法的檢出能力越強。
定性方法的LOD50約為 0.7CFU。但是，由于食品基質的影響，通常高于LOD50 0.7CFU，也就是說實際上增菌開始的時候需要更多的目標微生物才能達到 50%的檢出概率，目標微生物的生長受到食品基質的抑制。某些食品基質也可能使定性方法的LOD50低于0.7CFU，目標微生物的生長受到這些種類的食品基質的促進。
LOD50是用部分檢出水平的樣品進行試驗推算出的，并不是樣品實際要達到的濃度水平。制備檢出概率為50%的樣品是不可能實現(xiàn)的。實際情況是，制備一組部分檢出水平（陽性檢出率為 25-75% 之間）的樣品或制備幾個污染水平不同的樣品(其中至少有一個污染水平為部分檢出水平)，根據(jù)每個污染水平結果的陽性率和樣品的初始污染濃度計算獲得 LOD50。
LOD50與基質種類密切相關，不同基質種類通常有不同的LOD50。
7、部分檢出水平(factional detection level)
采用定性方法測試一組平行樣品時，檢出概率在 25%~75%時樣品的污染水平。
部分檢出水平是樣品中目標微生物的濃度水平需要滿足檢出概率在 25%~75%之間。GB4789.45中，部分檢出水平的樣品用于定性方法的靈敏度研究。
8、配對/非配對分析
兩種定性方法同時檢驗某一樣品時，若第一步增菌方法相同，可使用該樣品的同一試樣進行分析，該分析稱為“配對分析”；若第一步增菌方法不同，則使用該樣品的不同試樣分別進行分析，該分析稱為“非配對分析”。在ISO16140-2中主要用于替代方法的定性方法驗證研究。
9、準確度(accuracy)
準確度指測試結果與真值(或接受參考值)間的一致程度。
當用于一組測試結果時，準確度由系統(tǒng)誤差(偏倚)分量和隨機誤差(規(guī)定條件下的標準差)分量組成也就是說，準確度包含正確度和精密度。
準確度通常是針對定量方法來說的，但是定性方法重復測試獲得檢出率，將定性數(shù)據(jù)轉化為了定量數(shù)據(jù)，定性方法也可以計算準確度。
10、相對正確度研究（Relative trueness analysis）
相對正確度研究是對參考方法與替代方法獲得的結果之間的比較研究。
采用自然和/或人為污染的樣品，對不同的類別、類型以及項目進行測試。使用Bland-Altman 方法分析，并繪制散點圖，樣品中超出差值的總平均值的 95%置信區(qū)間的樣品數(shù)量不得高于 1:20的比例。
11、穩(wěn)健性（robustness study）
測試方法保持不受微小但不能忽略的參數(shù)變化影響的能力所進行的研究，表明方法正常使用的可靠性。
比如，金葡測試片穩(wěn)健性測試，采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌株，制備高濃度、中濃度和低濃度菌液。各5次重復，在34、36和38°C溫度下孵育24±2小時，以評估溫度變化。采用類似的方案來評估孵育時間的變化，各5個重復，在36±1℃下孵育20、24和28 h。
一般方法經(jīng)實驗室間充分驗證的方法，會略過此參數(shù)，因為實驗室間的驗證本身已經(jīng)引入了很多不確定性的因素，故沒有必要再重復穩(wěn)健性測試。這就是為什么 AOAC- PTM 驗證會進行穩(wěn)健性測試，而 OMA方法一般不會測試該參數(shù)。
12、重復性（repeatability）
重復條件下的精密度。
在同一實驗室，由同一操作人員使用相同的設備，在短時間間隔內，以相同的方法對相同的測試項目進行獨立的測試。
13、再現(xiàn)性（reproducibility）
再現(xiàn)性條件下的精密度。
在不同實驗室，由不同的操作員使用不同設備，按照同樣測試方法，對同一測試對象相互獨立進行的測試。
14、參考方法（Reference Method）
用于與待驗證方法進行比較的現(xiàn)有公認分析方法。如ISO方法、GB4789系列方法、BAM方法等。
15、基質（Matrix）
依據(jù)方法的預期用途納入確認的食品、飲料或環(huán)境表面材料等。
一般包括食品大類、子類（類型）、樣品。
如：乳與乳制品（食品大類）、發(fā)酵乳（子類）、光明如實酸奶（樣品，具體到產(chǎn)品本身）。
16、樣品（Sample）
從重復測試部分中取出用以分析的樣品基質。
樣品（自然污染的、未污染的或接種的）含有的分析物（如有）應濃度均勻。
以上術語大家要好好學習哦！
下一期跟大家分享參照GB4789.45如何設計驗證方案。
【參考文獻/內容來源】
1、書籍：《食品安全國家標準 微生物檢驗方法驗證通則》實時指南
2、ISO16140-2:2016 —替代（專有）方法對參考方法的驗證協(xié)議
3、AOAC 國際方法委員會食品及環(huán)境表面微生物方法的驗證指南（2012）
